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Plantcellwalls實驗試劑
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在我們實驗室分發(fā)細胞壁單克隆抗體超過20年之后，PlantProbes 的活動在2021年6月底停止了。我們感謝各地的研究人員對我們的細胞壁抗體所表現(xiàn)出的興趣，我們很高興它們繼續(xù)有用。抗體特異性和出版物鏈接抗體將繼續(xù)從其他來源獲得，包括 Kerafast、 Megazyme 和 Ximbio。褐藻多糖和藻酸鹽的 BAM 抗體可以在羅斯科夫的 SeaProbes 上買到。目前正在探索選擇這些試劑的其他途徑。JIM 和 MAC 抗體的選擇(AGPs/伸展蛋白)也可以從 CCRC/佐治亞大學的 Carbosource 獲得。如果你對 CBMs 感興趣，請注意里斯本的 NZYTech 有大量具有廣泛特異性的 CBMs。我們的抗體探針的概述列表和簡短指南我們的細胞壁抗體是高度敏感的，高度特異性和通用的分子工具，可用于顯微鏡分析和定量評估所有植物材料中的細胞壁聚合物，從水果和蔬菜到纖維和所有形式的植物生物量。我們很樂意討論探針的任何潛在用途或應用。任何關于我們抗體的詢問，請聯(lián)系 Paul Knox
細胞壁聚合物探針的產(chǎn)生我們的研究目標之一是產(chǎn)生用于原位分析細胞壁聚糖的特定探針。針對寡糖表位的單克隆抗體等探針是分析植物細胞壁多糖在生命周期中的時空分布及其修飾的重要工具。此外，它們是確定聚合物排列和單個細胞壁結構的必要工具。我們的探針一般是大鼠雜交瘤單克隆抗體。我們還探索了來自細胞壁水解酶的重組組氨基酸標記的碳水化合物結合模塊(CBMs)作為細胞壁組分的探針以類似于抗體的方式起作用的能力。聚糖單克隆抗體的產(chǎn)生并不簡單。其局限性包括聚糖的低免疫原性，這往往需要制備新糖蛋白免疫原。這涉及到一個確定的寡糖偶聯(lián)到一個免疫原性蛋白，如 BSA 或 KLH。這一策略導致了1,4-半乳聚糖，1,4-木聚糖，1,5-阿拉伯聚糖，1,4-甘露聚糖和木葡聚糖單克隆抗體的產(chǎn)生。一個復合因素是適當定義的寡糖的有限可用性，這些寡糖既是與蛋白質(zhì)和免疫原制備的偶聯(lián)所必需的，也是衍生抗體的角色塑造所必需的。我們參與生成的單克隆抗體的清單以及目前如何獲得樣品的細節(jié)可以在這里找到: 抗體。
我們的大鼠單克隆抗體以雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液的形式獲得，這些上清液含有(0.05% w/v)作為防腐劑。它們可以儲存在4攝氏度，在那里它們將保持活躍多年。它們可以被冷凍，但應避免重復的冷凍/解凍周期。所述抗體在含有阻斷蛋白如牛奶蛋白或 BSA 的 PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)中用作10倍至100倍的稀釋液。所有二級檢測抗體也應在此緩沖液中適當稀釋。抗體孵育的每個階段應進行至少1小時。培養(yǎng)大多在室溫下進行，而 O/N 培養(yǎng)可在4 °C 下進行。LM 和 JIM 系列單克隆抗體是 RAT 單克隆抗體，需要抗大鼠 IgG (全分子)二級試劑。使用我們的抗體/CBMs 在生物原型 Cornuault V，Knox JP (2014)三明治 ELISA 分析植物細胞壁聚糖連接的新方案。使用大鼠單克隆抗體在..。
免疫標記技術免疫熒光抗體免疫標記方法概述通過在磷酸鹽緩沖鹽水(MP/PBS)中與3% (w/v)牛奶蛋白孵育至少30分鐘，阻斷制備的細胞或粘附在玻片上的植物材料的非特異性結合位點。用稀釋于 MP/PBS 中的大鼠單克隆抗體在室溫下孵育至少1小時或在攝氏4度下孵育過夜。將雜交瘤上清液稀釋五倍是獲得第一抗體的良好起點。用三次 PBS 洗滌，每次洗滌至少5分鐘。與在 MP/PBS 中100倍稀釋的第二抗體一起在 RT 培養(yǎng)1小時。我們使用與 FITC (Sigma)清洗連接的抗大鼠 IgG (全分子)與三種 PBS 變化，每種變化至少5分鐘。使用防褪色試劑裝載載玻片并檢查。我們使用花旗熒光甘油為基礎的抗褪色切片。免疫金標記抗體免疫標記方法概述通過將 EM 網(wǎng)格切片側面漂浮在3% (w/v)牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(BSA/PBS)中的液滴(至少20ml)上防止非特異性結合在 Parafilm 上30分鐘。轉移網(wǎng)格到 BSA/PBS 稀釋液滴中的一抗。單克隆抗體應在5倍和100倍之間稀釋。通過至少三種 PBS 變化的溫育來洗滌柵格。將柵格轉移到用 BSA/PBS 稀釋20分之一的二抗。我們使用與10nm 金(Sigma)偶聯(lián)的抗大鼠 IgG。像步驟3那樣洗，然后在蒸餾水中廣泛地洗。讓網(wǎng)格干燥，然后用電子顯微鏡檢查。2022年利茲大學，利茲，LS29JT 條款和條件版權無障礙隱私和 Cookie
基于硝酸纖維素的免疫化學測定和免疫印刷免疫點測定/組織印刷方法概述通過用軟鉛筆仔細劃線，在適當大小的硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell)上標出測定位點。我們使用5毫米 x 5毫米正方形。將1μl 溶于水或適當緩沖液中的試驗化合物等分試樣施加于硝化纖維素上，并晾干1小時。使用稀釋級數(shù)是有用的?；蛘撸谱髑衅参锊牧系慕M織印刷或制作顯示根系的印刷以研究多糖分泌物。用3% (w/v)乳蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(MP/PBS)中孵育1小時以阻斷所有結合位點。在第一抗體中培養(yǎng)1.5小時。大鼠雜交瘤上清液在 MP/PBS 中稀釋至少10倍。在大多數(shù)情況下，我們發(fā)現(xiàn)自來水可以作為 PBS 的合適替代品。將抗大鼠 IgG (全分子)與辣根過氧化物酶(HRP) ，Sigma)在 MP/PBS 中稀釋1000倍的區(qū)域中孵育1.5小時。在 PBS 中大量洗滌。參見步驟4。通過在使用前立即制備的酶標記底物(例如 HRP 底物: 25ml 去離子水，含10mg/ml 4-氯 -1-萘酚的5ml 甲醇，30μl6% (v/v)過氧化氫)中溫育，確定抗體與硝化纖維素的結合。在使用前立即制備) ，并容許。當黑點出現(xiàn)在抗原位點時，通過在自來水中大量清洗來停止反應。微量滴定板法(ELISA)抗體捕獲方法概述 ELISA 將用作固定抗原的樣本調(diào)整至50mM 碳酸，pH9.6，濃度為 c.50 μg/ml。向微量滴定板的適當孔中加入100μl 抗原，并在4 °C (或 RT 時2小時)溫育過夜。具有無抗原的孔對于確定無抗體結合的信號是有用的。用洗滌法去除含有抗原的溶液。用200μl/孔3% (w/v)牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(BSA/PBS)中，在室溫下或在4 °C 時用 O/N 封閉平板上的所有結合位點2小時。用 PBS 洗盤子。最容易做到這一點的方法是將盤子反復浸入裝滿 PBS 的托盤中，搖晃，然后強行將 PBS 扔出(扔進水槽)。這句話重復了十次。在我們的手中，自來水往往可以是一個合適的替代洗滌介質(zhì)。在適當稀釋的 BSA/PBS 中加入100μl/孔的一抗至少1.5小時。作為指導，將大鼠雜交瘤上清液稀釋10倍，然后稀釋5或10倍。按步驟5洗盤子15次。加入100μl/孔的第二抗體(例如抗大鼠 IgG (整個分子)偶聯(lián)至辣根過氧化物酶(HRP) ，Sigma) ，在 BSA/PBS 中稀釋1000倍。孵育至少1.5小時。按步驟5洗盤子15次。通過加入使用前立即制備的150μl/孔 HRP 底物(18ml 去離子水，2ml 1M 醋酸鈉緩沖液 pH6.0,200μl 四甲基聯(lián)苯，20μl 6% (v/v)過氧化氫)來確定抗體與平板的結合。加入50μl/孔的2.5 M 硫酸可停止顯色。吸光度測定在450納米在微板讀數(shù)器?？贵w滴定曲線圖。A在第二種類型的競爭抑制 ELISA 中，抗原-抗體相互作用的定量*處于可溶性階段。競爭抑制 ELISA 可以對所有抗原進行非常靈敏的定量分析。這是一個特別適合的技術，以測定抗體結合半抗原或小分子，不能有效地堅持微量滴定板。競爭抑制 ELISA 必須分兩個步驟進行，如圖 A 和圖 B 所示。首先，使用抗體捕獲 ELISA 和抗體針對恒定水平的固定抗原的滴定來確定抗體的工作稀釋度(見上文和圖1)。答)。在第二步中使用提供90% 最大結合力的抗體稀釋法，因為在這種稀釋法中，抗體結合對抑制作用最敏感。通過存在可溶性抗原或半抗原來抑制與固定化抗原結合的這種水平的抗體，如下所述和如下圖所示費格。競爭抑制 ELISA 半抗原滴定曲線方法綜述。用抗原(固定的抗原)包被微量滴定板并用 BSA/PBS 封閉。確定在抗體捕獲 ELISA 中與該抗原最大結合的90% 的一級抗體稀釋度(x)(參見上文和圖1)。答)。在微量滴定板的適當孔中加入50μl/孔的連續(xù)稀釋的可溶性抗原或 PBS 中的半抗原。作為指導，從2毫克/毫升開始，準備10倍稀釋液。在 BSA/PBS 的第3步中，將50μl/孔的第一抗體以2倍的濃度加入到每個含有抗原的孔中。這將使抗原的最終濃度為1毫克/毫升(10倍稀釋)和抗體濃度為 x。輕輕攪動微量滴定板以確保混合。至少培養(yǎng)1.5小時。用 PBS 洗盤子。最容易做到這一點的方法是將盤子反復浸入裝滿 PBS 的托盤中，搖晃，然后強行將 PBS 扔出(扔進水槽)。這至少重復了15次。在我們的手中，自來水往往可以是一個合適的替代洗滌介質(zhì)。加入100μl/孔的第二抗體(例如抗大鼠 IgG (整個分子)偶聯(lián)至辣根過氧化物酶(HRP) ，Sigma) ，在 BSA/PBS 中稀釋1000倍。孵育至少1.5小時。執(zhí)行上述抗體捕獲 ELISA 方案中的步驟8至13。如圖所示，確定抑制抗體結合所需的抗原濃度為50% 。B.這就是 IC50。通過比較一系列抗原的 IC50，可以很好地指示特定抗體識別這些抗原的程度。
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